Risoluzione dei lipidi nelle cellule viventi: una nuova scoperta nella microscopia fotoacustica iperspettrale a infrarosso medio

I lipidi non sono solo componenti strutturali delle membrane cellulari e delle molecole di stoccaggio dell'energia, ma sono anche strettamente correlati all'insorgenza e allo sviluppo di cancro, obesità, diabete,malattie cardiovascolariTuttavia, l'osservazione diretta e la distinzione tra i diversi tipi di lipidi nelle cellule viventi hanno a lungo dovuto affrontare sfide tecniche.I metodi tradizionali di etichettatura fluorescente sono limitati dall'efficienza dell'etichettatura, specificità e potenziale interferenza con le funzioni cellulari, mentre le tecniche ottiche senza etichetta spesso faticano a distinguere le molecole lipidiche con strutture chimiche simili.

Nature Methods ha pubblicato uno studio che introduce una tecnologia chiamata "Hyperspectral Fingerprint-region Photoacoustic Microscopy" (hyFOPM).Utilizzando le modalità di vibrazione a singolo legame nella regione centrale dell'impronta digitale a infrarossi, questa tecnologia consente il rilevamento senza etichette e la rappresentazione dinamica della sfingomielina (SM) e del colesterolo (Chol) nelle cellule viventi.

Principi tecnici
La maggior parte dei metodi ottici senza etichetta si basa su segnali nella regione di vibrazione di allungamento C-H (circa 2800 ∼ 3000 cm−1), ma le bande spettrali in questa regione sono molto simili tra vari lipidi,rendendo difficile distinguere i diversi tipiAl contrario, la regione delle impronte digitali a infrarosso medio (900 ̊1730 cm−1) contiene più informazioni di vibrazione a singolo legame che riflettono la struttura unica delle molecole.come l'assorbimento caratteristico dei legami amidici, legami esteri e anelli steroidei.

Il progetto del sistema hyFOPM si concentra su questo concetto. Impiega un laser a cascata quantistica sintonizzabile come fonte di eccitazione, che copre il range 900 ∼2932 cm−1 con una risoluzione spettrale di 2 cm−1.Impulsi laser eccitano il campione per generare segnali fotoacusticiIl sistema ha una risoluzione spaziale di circa 4,3 μm, consentendo l'imaging a livello di cellule viventi.

Validazione dei modelli lipidici
Per verificare la fattibilità della tecnologia, il gruppo di ricerca ha prima preparato modelli bidimensionali di soluzioni lipidiche contenenti colesterolo (Chol), fosfatidilcolina insatura (DOPC),e sfingomielina (SM).

(1)Confronto delle caratteristiche spettrali

Gli spettri della regione delle impronte digitali raccolti da hyFOPM sono altamente coerenti con i risultati ATR-FTIR.il colesterolo presenta un forte picco di assorbimento per la deformazione dell'anello steroideo a 1056 cm−1; DOPC presenta vibrazione di allungamento C=O del gruppo estero a 1731 cm−1; e la sfingomielina corrisponde alla banda di amide I, banda di amide II e vibrazione di piegatura dell'acido grasso CH2 a 1645 cm−1,1555 cm−1, e 1464 cm−1, rispettivamente.

(2)Capacità di smistamento e classificazione spettrale
Quando si utilizzano solo 15 numeri d'onda nella regione delle impronte digitali per la de-miscelazione lineare, il crosstalk tra colesterolo e sfingomielina è vicino allo 0%, mentre il crosstalk per DOPC è del 23%.la crosstalk aumenta significativamente quando si utilizzano 7 numeri d'onda nella regione di allungamento C-HUn'ulteriore applicazione dell'analisi discriminante lineare (LDA) mostra che l'accuratezza media di classificazione raggiunge il 96% quando si utilizza la regione delle impronte digitali o la regione C-H.e raggiunge il 97% quando si utilizzano tutti i numeri d'onda.

(3)Modelli di vescicole unilamelari giganti (GUV)
Lo studio ha preparato tre tipi di GUV per simulare le membrane cellulari: Modello 1, una miscela 1:1 di SM e Chol, formando una membrana ordinata densa; Modello 2, a 2:2:1 miscela di DOPC, SM e Chol, coesistenti in fasi liquide ordinate e disordinate; e Modello 3, DOPC puro, che forma una membrana fluida disordinata.Le immagini acquisite da hyFOPM a 2852 cm-1 sono morfologicamente coerenti con quelle ottenute con colorazione fluorescente del Nilo rossoLe caratteristiche spettrali delle diverse vescicole corrispondono a lipidi puri, confermando che i singoli componenti delle membrane miste possono essere identificati.

(4)Applicazioni per il controllo della qualità
Eseguendo misurazioni spettrali su 10 differenti GUV per ciascun tipo e tracciando diagrammi di fase ternari,il gruppo di ricerca ha scoperto che la composizione lipidica effettiva si discostava dal rapporto obiettivo (una discrepanza di circa il 40%)Ciò indica che l'hyFOPM può essere utilizzato per la valutazione della qualità nella preparazione di GUV.

Applicazioni nelle cellule viventi
Lo studio ha ulteriormente applicato l'hyFOPM alle cellule viventi, osservando i cambiamenti dinamici della sfingomielina e del colesterolo in due modelli cellulari, rispettivamente.

(1) Accumulazione di sfingomielina nelle cellule A549
Le cellule di adenocarcinoma polmonare umano (A549) sono state trattate con il composto antitumorale acido 2-idrossioleico (2-OHOA), che dovrebbe indurre l' accumulo di sfingomielina.Sono stati raccolti da 50 cellule spettri della regione delle impronte digitali (1600 ∼ 1400 cm−1)., mostrando che l' area di picco di 1464 cm-1 è aumentata del 117% dopo il trattamento, rispetto a solo il 23% nel gruppo di controllo nello stesso periodo.L'imaging è stato eseguito su 3000 cellule utilizzando solo quattro numeri d'onda (2852 cm−1 per i lipidi totali)I risultati hanno mostrato che il segnale della sfingomielina ha continuato ad aumentare a 48 e 72 ore dopo il trattamento.mentre il segnale del colesterolo non ha mostrato cambiamenti significativi.

(2) Carico di colesterolo nelle cellule HEK
Le cellule renali embrionali umane (HEK293) sono state co-incubate con un complesso metil-β- ciclodestrina- colesterolo (MβCD-Chol) per aumentare il colesterolo nella membrana cellulare.Lo spettro della regione delle impronte digitali di 50 cellule ha mostrato che l' area di picco di 1048 cm-1 è aumentata del 161% dopo il trattamento., mentre il picco di 1464 cm−1 per la sfingomielina è leggermente diminuito, in linea con la proprietà nota che la ciclodestrina estrae alcuni lipidi della membrana fornendo colesterolo.L'imaging multi-onda di 3000 cellule ha confermato ulteriormente l'innalzamento del segnale di colesterolo, con un leggero aumento del segnale lipidico totale e poca variazione del segnale proteico.

Significato e prospettive
Questo studio dimostra la capacità di distinguere le molecole lipidiche con strutture chimiche simili nelle cellule viventi senza etichettatura.Rispetto ai metodi tradizionali basati sull'etichettatura fluorescente o isotopica, l'hyFOPM evita problemi quali l'efficienza dell'etichettatura e l'interferenza con le funzioni cellulari,e la sua selettività può essere adattata in modo flessibile alle caratteristiche spettrali dei lipidi bersaglio regolando i numeri di onda di eccitazione.

La specificità spettrale del sistema attuale nella regione delle impronte digitali è superiore a quella della regione di allungamento C-H, il che apre possibilità per distinguere più sottotipi lipidici.Lo studio sottolinea inoltre che la combinazione di tecniche avanzate di smistamento spettraleInoltre, la microscopia fotoacustica a infrarosso medio può raggiungere una profondità di imaging superiore a 150 μm nel tessuto,e applicazioni future possono essere estese a campioni spessi o in ambienti in vivoL'accelerazione tecnologica (ad es.L'analisi spettrale di sotto campionamento) e la miniaturizzazione del sistema sono direzioni importanti per far progredire questa tecnologia verso l'analisi del punto di cura o i test di laboratorio di routine.